Медицина для Вас

Укрепляем своё Здоровье!

Что такое ПЦР анализ при гепатите С?

В зависимости от желаемой информации существуют различные методы для анализа продуктов реакции ПЦР (полимеразная цепная реакция). Электрофорез в агарозном геле является типичным методом для определения наличия или отсутствия целевого ряда и длины фрагмента.

Методы обнаружения аномалий, такие как денатурирующий гель-электрофорез (DGGE) и гель-электрофорез с временным уровнем температуры (TTGE), используют акриламидный гель для определения мутаций в пункте ПЦР.

Стратегии полуколичественного анализа позволяют использовать электрофорез в агарозном геле для приближения исходного количества материала. Последовательность и стратегия секвенирования следующего поколения используются, когда необходимо определить серию ампликона.

Принципы

ПЦР увеличивает специфическую область ДНК (цель ДНК). Многие ПЦР подходят для амплификации фрагментов ДНК в диапазоне от 0,1 до 10 килоновых базовых наборов (kbp), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 килоновых базовых наборов.

Количество амплифицированного продукта определяется доступными субстратами в реакции, которые становятся предельными по мере продвижения реакции.

 ПЦР пробирки

ПЦР пробирки

Для базовой установки ПЦР требуется ряд деталей и реагентов, состоящий из:

  • Шаблон дизайна ДНК, который содержит область ДНК-мишени для увеличения
  • ДНК-полимеразу, фермент, который полимеризует совершенно новые нити ДНК; термостойкая Taq-полимераза является особенно типичной, поскольку она, скорее всего, остается нетронутой в процессе высокотемпературной денатурации ДНК
  • Две направляющие ДНК, которые являются комплементарными 3′-трем целым концам каждой из смысловых и антисмысловых нитей ДНК-мишени (ДНК-полимераза может просто связываться и удлиняться из двухцепочечной области ДНК, без праймеров не является двухцепочечным участком инициации, при котором полимераза может связываться); конкретные направляющие, которые дополняют область ДНК-мишени, заблаговременно выбираются и обычно настраиваются в лаборатории или приобретаются у бизнес-биохимических поставщиков
  • Дезоксинуклеозидтрифосфаты или dNTP (иногда называемые «дезоксинуклеотидтрифосфаты», нуклеотиды, включая трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза производит совершенно новую ДНК-цепь
  • Вариант буфера, обеспечивающий идеальную химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы
  • Двухвалентные катионы, обычно магниевые (Mg) или ионы марганца (Mn); Mg2+ является наиболее распространенным, однако Mg2+ может использоваться для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК, так как большая концентрация Mg2+ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК
  • Одновалентные катионы, обычно ионы калия (К)
G-Storm термоциклер

G-Storm термоциклер

Реакцию обычно проводят в объеме 10-200 мкл в небольших реакционных трубках (0,2 — 0,5 мл) в термоциклере. Термический велосипед нагревает и охлаждает ответные трубки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции.

Многие современные термоциклеры используют результат Пельтье, который позволяет как охлаждать, так и нагревать блок, удерживающий трубки ПЦР, просто путем изменения существующего электрического тока. Тонкостенные ответные трубки обеспечивают полезную теплопроводность для обеспечения быстрого теплового равновесия.

Большинство термоциклов имеют нагретые крышки, чтобы избежать конденсации в верхней части ответной трубки. У старых термоциклов, у которых нет нагретой крышки, нужен слой масла поверх реакционной смеси или шарик из воска внутри трубки.

ПЦР машина

ПЦР машина

Гель-электрофорез

Продукты ПЦР наиболее часто исследуются электрофорезом в агарозном геле. Результаты могут быть представлены бромистым этидием или нетоксичными красителями, такими как SYBR ® green.

Интенсивность полосы может быть использована для оценки количества продукта предлагаемой молекулярной массы относительно лестницы. Гель-электрофорез также выявляет специфичность ответа, когда наличие нескольких полос показывает вторичные продукты амплификации.

Семиколичественный анализ

ПЦР и обратная транскриптаза ПЦР (RT-PCR) обычно используются для обнаружения видов ДНК и РНК соответственно. Однако количественное применение этих подходов было ограничено.

Теоретически ПЦР значительно увеличивает матричную ДНК с удвоением шаблона дизайна каждый цикл, так что относительные различия между образцами могут быть измерены как интенсивность полос на геле.

Ограничение заключается в том, что на более поздних стадиях ПЦР эффективность снижается, а усиление достигает плато. Это означает, что количество элемента в реакции больше не пропорционально количеству исходного материала и не может быть измерено.

Относительные количества амплифицированной ДНК в разных ответах ПЦР можно сравнивать только тогда, когда реакции все еще находятся на быстрой стадии амплификаций. По этим причинам qPCR является наиболее часто используемым методом количественного анализа.

Если для обеспечения того, чтобы насыщение на самом деле не было достигнуто, требуется надлежащий уход, конечная ПЦР может быть успешно использована в качестве полуколичественной процедуры относительных различий в вводе шаблона дизайна между образцами.

Чтобы гарантировать, что ответ находится в быстрой фазе амплификации, образцы могут быть увеличены с увеличением разнообразия циклов, работы с гель-электрофорезом и количественно с помощью гелеобразователя и программного обеспечения. Конкретные методы полуколичественной ПЦР включают относительную RT-PCR и конкурентную RT-PCR.

В относительной RT-PCR разработаны два набора праймеров для мультиплексированной реакции ПЦР — один для интересующего гена, а другой для служебного хозяйства. Наборы праймеров необходимо создавать, чтобы не образовывать димеры и образовывать продукты с достаточно различной длиной, которые они могут быть дифференцированы с помощью гель-электрофореза.

Экспериментальные эксперименты должны проводиться для проверки продукта после различных циклов и для определения экспоненциальной фазы реакции для обоих наборов грунтов.

Используя программное приложение для создания изображений геля для определения прочности полосы, затем можно определить относительное изменение складки между образцами, стабилизированными на ген для служебного хозяйства.

Трудность в этом методе состоит в том, что гены служебной работы, необходимые для нормализации, обычно имеют гораздо более высокую экспрессию, чем представляющий интерес ген.

Одним из способов решения этой проблемы является использование низкоуглеродистых генов служебного хозяйства и использование более высоких концентраций праймеров для интересующего гена и более низкие концентрации направляющих для гена для служебного хозяйства в целях развития продукта с более низким выражением.

В конкурентной RT-PCR в образцах производится и увеличивается объемная РНК или контроль ДНК. Элемент управления должен быть сконструирован таким образом, чтобы он состоял из последовательностей связывания праймера, поскольку цель, однако, даст элемент различной длины.

Затем контроль поливают вниз на основную кривую распознанной концентрации и выдавливают в репродукцию образца. Экзогенный контроль и образец соответствуют направляющим и другим компонентам реакции и расширяются в две уникальные полосы.

Сравнение прочности полосы для образца с контролем распознанного количества дает полуколичественную меру количества записей в образце.

Желаем Вам не болеть!

 

Updated: 30.07.2017 — 17:32

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Сайт носит исключительно информационный характер и не является заменой профессиональной диагностики и лечения. Медицина для Вас ©2017 medsovet103.ru